sábado, 9 de junio de 2012

Procedimiento de clonación génica. Etapas.



    El experimento consiste en conseguir bacterias a las que se le ha insertado un trozo de ADN de otro organismo distinto. Por ejemplo conseguir una bacteria que tenga en su ADN un gen humano de la insulina. Cuando la bacteria se divide también replica el ADN insertado. Además la bacteria puede expresar el gen humano y fabricar insulina humana en grandes cantidades. Esta insulina se usa para la diabetes.
Figura 1. Desarrollo de un procedimiento de clonación génica.

http://youtu.be/7IALHy66pcg
 Etapas de  clonación génica:
1ª etapa: Preparacion del ADN
El gen, fragmento de gen o fragmento de ADN que se quiere clonar  debe ser aislado de la muestra. 
Rotura con endonucleasa de restriccion y  separación de fragmentos.
2ª etapa: preparación del vector
Como vector de clonación se puede utilizar un plásmido, 
un cósmido, un virus ... Su propiedad esencial es que sean autorepliegativos.
3ª etapa: unión del ADN al vector
Habiendo cortado el ADN y el vector con una misma endonucleasa de restricción, ambos pueden unirse gracias a una ligasa. 
4ª etapa: incorporacion del ADNr
El ADN recombinante se introduce en bacterias,empleando métodos diversos. El  vector  se replica al dividirse la bacteria y también de forma autónoma. Con ello, aumenta el número de copias. Cada bacteria, haya  incorporado o no un  vector y un ADN rcombinante, se multiplica para dar lugar a un "clon", población de bacterias con idéntico material genético ( incluido el recombinante) 
5ª y 6ª etapas (simultáneas) :  propagación celular  y selección.
No todas las bacterias han incorporado el DNA de interés formando parte del vector recombinante. Se seleccionan las que sí  lo han hecho, normalmente cultivándolas en un medio con antibiótico, si en el vector se  incluyó el gen de resistencia a ese antibiótico.
7ª etapa (opcional ) :  expresión del  DNA clonado



Figura 2. Procedimiento de inserción de un gen en un plásmido y amplificación del ADN clonado. Tanto el plásmido como la secuencia blanco del ADN a clonar se cortan con la misma enzima, en este caso Eco R1 que produce extremos pegajosos. Al mezclar en un tubo  de ensayo el ADN plasmídico y la secuencia de ADN foráneo se hibridizan y luego de la acción de una ligasa agregada al medio forman un plásmido híbrido que contiene el gen de interés. Luego se procede a transferir el ADN recombinante a una bacteria, este proceso es fácil de realizar. Se procede luego a transferir las bacterias a un medio de cultivo donde se multiplican. A partir de este crecimiento se siembran en un medio sólido (ver figura 14) conteniendo el antibiótico al que es resistente la bacteria que porta el plásmido, es decir que sólo van a crecer las bacterias que contienen el ADN recombinante. Luego a partir de las colonias se hace un cultivo en medio líquido para amplificar y de ese cultivo se purifica el ADN con el inserto.

   Experimentos similares pueden hacerse para insertar ADN extraño en eucariotas como plantas y animales: